BD Horizon? Fixable Viability Stain 780 （FVS780） 可用于在多色流式細胞術(shù)應(yīng)用中區(qū)分活細胞和非活哺乳動物細胞。該染料與細胞表面和細胞內(nèi)胺反應(yīng)并共價結(jié)合。與非滲透性活細胞相比，可滲透性漿細胞膜（例如壞死細胞中存在的漿細胞膜）允許染料在細胞內(nèi)擴散并與更高總濃度的胺共價結(jié)合。因此，存在于典型體外測定標記物中的壞死細胞 具有更高水平的染料，其熒光強度比活細胞的熒光強度高 10-20 倍。標記的細胞可以用甲醛固定，用于下游去污、冷凍和/或透化以及隨后的細胞內(nèi)染色，同時保持穩(wěn)定的活力染色熒光。
推薦的實驗流程
制備
將 FVS780 染料粉末和 180 μl 新鮮細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加熱至室溫。加入 180 μl DMSO 并充分渦旋溶液。檢查溶液并重復(fù)渦旋，直到染料儲備液完全溶解。這是 Stock Solution。
存儲
到達后，將干燥的染料干燥并避光儲存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 復(fù)溶后，將儲備液分小份儲存在 -20°C 下。儲存 90 天后請勿使用重組染料。用 DMSO 重構(gòu)后 90 天后，請丟棄染料溶液。
細胞術(shù)要求
可以使用配備紅色激光的流式細胞儀（例如，BD FACSCanto? II、BD? LSR II、BD LSRFortessa? 或 BD Accuri? C6）。這種染料可以從通常用于 APC-Cy?7 的濾光片（例如，780/60）中讀出。使用感興趣的細胞樣品最好實現(xiàn)熒光補償。在設(shè)計多色染色組合時，請注意熒光溢出到 BD Horizon? BUV737、BD Horizon? BV786 和 PE-Cy?7（當讀取黃綠色激光時）通道。應(yīng)優(yōu)化面板以考慮這種溢出效應(yīng)。為了減少熒光溢出，我們建議滴定 FVS780 并使用盡可能低的染料濃度，以提供足夠分辨率的目標活細胞和死細胞群。
程序
細胞的 Fixable Viability Stain 780 標記
1. 使用不含疊氮化鈉的緩沖液制備用于流式細胞術(shù)染色的細胞。
2. 用不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水 （1X DPBS） 洗滌細胞一次。
3. 在不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 個細胞/ml 的濃度重懸細胞。
4. 每1 ml細胞懸液（1：1000）中加入1 μl BD Horizon Fixable? Viability Stain 780儲備液，并立即渦旋。
a. 注意：我們建議滴定染料以獲得最佳性能，因為不同的細胞類型和不同的應(yīng)用會導致染色出現(xiàn)很大程度的可變性。
5. 將混合物在室溫下避光孵育 10-15 分鐘。
a. 可選：或者，將混合物在 37°C 下孵育 5-7 分鐘，或在 2-8°C 下孵育 30-60 分鐘。
6. 用 2 ml BD Pharmingen? 染色緩沖液 （FBS） 洗滌細胞兩次（貨號）。編號 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并輕輕混合以破壞細胞沉淀。
8. 在染色緩沖液 （FBS） 或等效物中重懸細胞。
9. 根據(jù)需要對細胞進行染色、固定和透化，以用于下游應(yīng)用。
推薦的實驗流程
制備
將 FVS780 染料粉末和 180 μl 新鮮細胞培養(yǎng)級二甲基亞砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加熱至室溫。加入 180 μl DMSO 并充分渦旋溶液。檢查溶液并重復(fù)渦旋，直到染料儲備液完全溶解。這是 Stock Solution。
存儲
到達后，將干燥的染料干燥并避光儲存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 復(fù)溶后，將儲備液分小份儲存在 -20°C 下。儲存 90 天后請勿使用重組染料。用 DMSO 重構(gòu)后 90 天后，請丟棄染料溶液。
細胞術(shù)要求
可以使用配備紅色激光的流式細胞儀（例如，BD FACSCanto? II、BD? LSR II、BD LSRFortessa? 或 BD Accuri? C6）。這種染料可以從通常用于 APC-Cy?7 的濾光片（例如，780/60）中讀出。使用感興趣的細胞樣品最好實現(xiàn)熒光補償。在設(shè)計多色染色組合時，請注意熒光溢出到 BD Horizon? BUV737、BD Horizon? BV786 和 PE-Cy?7（當讀取黃綠色激光時）通道。應(yīng)優(yōu)化面板以考慮這種溢出效應(yīng)。為了減少熒光溢出，我們建議滴定 FVS780 并使用盡可能低的染料濃度，以提供足夠分辨率的目標活細胞和死細胞群。
程序
細胞的 Fixable Viability Stain 780 標記
1. 使用不含疊氮化鈉的緩沖液制備用于流式細胞術(shù)染色的細胞。
2. 用不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水 （1X DPBS） 洗滌細胞一次。
3. 在不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 個細胞/ml 的濃度重懸細胞。
4. 每1 ml細胞懸液（1：1000）中加入1 μl BD Horizon Fixable? Viability Stain 780儲備液，并立即渦旋。
a. 注意：我們建議滴定染料以獲得最佳性能，因為不同的細胞類型和不同的應(yīng)用會導致染色出現(xiàn)很大程度的可變性。
5. 將混合物在室溫下避光孵育 10-15 分鐘。
a. 可選：或者，將混合物在 37°C 下孵育 5-7 分鐘，或在 2-8°C 下孵育 30-60 分鐘。
6. 用 2 ml BD Pharmingen? 染色緩沖液 （FBS） 洗滌細胞兩次（貨號）。編號 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并輕輕混合以破壞細胞沉淀。
8. 在染色緩沖液 （FBS） 或等效物中重懸細胞。
9. 根據(jù)需要對細胞進行染色、固定和透化，以用于下游應(yīng)用。
