BD Horizon? Fixable Viability Stain 660 （FVS660） 可用于在多色流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用中區(qū)分活細(xì)胞和非活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該染料與細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)胺反應(yīng)并共價(jià)結(jié)合。與非滲透性活細(xì)胞相比，可滲透性漿細(xì)胞膜（例如壞死細(xì)胞中存在的漿細(xì)胞膜）允許染料在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散并與更高總濃度的胺共價(jià)結(jié)合。因此，存在于典型體外測定標(biāo)記物中的壞死細(xì)胞 具有更高水平的染料，其熒光強(qiáng)度比活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度高 10-20 倍。標(biāo)記的細(xì)胞可以用甲醛固定，用于下游去污、冷凍和/或透化以及隨后的細(xì)胞內(nèi)染色，同時(shí)保持穩(wěn)定的活力染色熒光。
BD Horizon? Fixable Viability Stain 660 由紅色激光激發(fā)（最大激發(fā)波長為 649 nm），最大熒光發(fā)射波長為 660 nm。
推薦的實(shí)驗(yàn)流程
制備
將 FVS660 染料粉末和 190 μl 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加熱至室溫。加入 190 μl DMSO 并充分渦旋溶液。檢查溶液并重復(fù)渦旋，直到染料儲(chǔ)備液完全溶解。這是 Stock Solution。
存儲(chǔ)
到達(dá)后，將干燥的染料干燥并避光儲(chǔ)存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 復(fù)溶后，將儲(chǔ)備液分小份儲(chǔ)存在 -20°C 下。儲(chǔ)存 90 天后請勿使用重組染料。用 DMSO 重構(gòu)后 90 天后，請丟棄染料溶液。
細(xì)胞術(shù)要求
可以使用配備紅色激光的流式細(xì)胞儀（例如，BD FACSCanto? II、BD LSRFortessa?、BD? LSR II 或 BD Accuri? C6）。該染料可以從通常用于 APC 或 Alexa Fluor? 647 的濾光片（例如 660/20 或 670/30）中讀取。最好使用目標(biāo)細(xì)胞的樣品進(jìn)行熒光補(bǔ)償。
程序
可固定活力染色劑 660 細(xì)胞標(biāo)記
1. 使用不含疊氮化鈉的緩沖液制備用于流式細(xì)胞術(shù)染色的細(xì)胞。
2. 用不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水 （1X DPBS） 洗滌細(xì)胞一次。
3. 在不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 個(gè)細(xì)胞/ml 的濃度重懸細(xì)胞。
4. 每1 ml細(xì)胞懸液（1：1000）加入1 μl BD Horizon Fixable? Viability Stain 660儲(chǔ)備液，并立即渦旋。
a. 注意：我們建議滴定染料以獲得最佳性能，因?yàn)椴煌募?xì)胞類型和不同的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致染色出現(xiàn)很大程度的可變性。請閱讀下面的注釋 1 以獲取有關(guān)推薦范圍的指導(dǎo)。
5. 將混合物在室溫或 2-8°C 避光孵育 10-15 分鐘。
a. 可選：或者，將混合物在 37°C 下孵育 5-7 分鐘。
6. 用 2 ml BD Pharmingen? 染色緩沖液 （FBS） 洗滌細(xì)胞兩次（貨號(hào)）。編號(hào) 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并輕輕混合以破壞細(xì)胞沉淀。
8. 在染色緩沖液 （FBS） 或等效物中重懸細(xì)胞。
9. 根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色、固定和透化，以用于下游應(yīng)用。
BD Horizon? Fixable Viability Stain 660 由紅色激光激發(fā)（最大激發(fā)波長為 649 nm），最大熒光發(fā)射波長為 660 nm。
推薦的實(shí)驗(yàn)流程
制備
將 FVS660 染料粉末和 190 μl 新鮮細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜 （DMSO;例如，Sigma D2650） 加熱至室溫。加入 190 μl DMSO 并充分渦旋溶液。檢查溶液并重復(fù)渦旋，直到染料儲(chǔ)備液完全溶解。這是 Stock Solution。
存儲(chǔ)
到達(dá)后，將干燥的染料干燥并避光儲(chǔ)存在 -80°C 下直至使用。用 DMSO 復(fù)溶后，將儲(chǔ)備液分小份儲(chǔ)存在 -20°C 下。儲(chǔ)存 90 天后請勿使用重組染料。用 DMSO 重構(gòu)后 90 天后，請丟棄染料溶液。
細(xì)胞術(shù)要求
可以使用配備紅色激光的流式細(xì)胞儀（例如，BD FACSCanto? II、BD LSRFortessa?、BD? LSR II 或 BD Accuri? C6）。該染料可以從通常用于 APC 或 Alexa Fluor? 647 的濾光片（例如 660/20 或 670/30）中讀取。最好使用目標(biāo)細(xì)胞的樣品進(jìn)行熒光補(bǔ)償。
程序
可固定活力染色劑 660 細(xì)胞標(biāo)記
1. 使用不含疊氮化鈉的緩沖液制備用于流式細(xì)胞術(shù)染色的細(xì)胞。
2. 用不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 Dulbecco 磷酸鹽緩沖鹽水 （1X DPBS） 洗滌細(xì)胞一次。
3. 在不含疊氮化鈉和蛋白質(zhì)的 1X DPBS 中以 1-10x10^6 個(gè)細(xì)胞/ml 的濃度重懸細(xì)胞。
4. 每1 ml細(xì)胞懸液（1：1000）加入1 μl BD Horizon Fixable? Viability Stain 660儲(chǔ)備液，并立即渦旋。
a. 注意：我們建議滴定染料以獲得最佳性能，因?yàn)椴煌募?xì)胞類型和不同的應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致染色出現(xiàn)很大程度的可變性。請閱讀下面的注釋 1 以獲取有關(guān)推薦范圍的指導(dǎo)。
5. 將混合物在室溫或 2-8°C 避光孵育 10-15 分鐘。
a. 可選：或者，將混合物在 37°C 下孵育 5-7 分鐘。
6. 用 2 ml BD Pharmingen? 染色緩沖液 （FBS） 洗滌細(xì)胞兩次（貨號(hào)）。編號(hào) 554656） 或同等值。
7. 倒出上清液并輕輕混合以破壞細(xì)胞沉淀。
8. 在染色緩沖液 （FBS） 或等效物中重懸細(xì)胞。
9. 根據(jù)需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色、固定和透化，以用于下游應(yīng)用。
