產(chǎn)品名稱：一步克隆試劑盒
產(chǎn)品簡介：
NobleRyder? One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)，可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點?？梢愿咝Ъ嫒?-5個片段同源重組，50℃反應10 - 30 min即可進行連接，適用于快速克隆，DNA定點突變等。
實驗流程
1.制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。盡量選擇無重復序列且載體克隆位點上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。載體線性化方式有限制性內(nèi)切酶酶切消化和反向PCR擴增。1）酶切制備線性化載體時，推薦使用雙酶切線性化，線性化完全5.1 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化。選擇載體克隆位點附近無重復序列且上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。
1）酶切制備線性化載體，推薦使用雙酶切方案；單酶切線性化并不影響無縫鏈接，但可能會有更多的環(huán)狀質(zhì)粒殘留，增加后期克隆的篩選難度。
2）反向PCR擴增制備線性化載體，必須使用高保真DNA聚合酶進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR產(chǎn)物需要進行膠回收，減少環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀DNA模板的殘留。
2.制備插入片段
通過在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5，端和3，端的末端分別帶有與線性化載體的兩個末端對應的完全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴增，獲得PCR產(chǎn)物后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收正確的產(chǎn)物片段。
插入片段正向擴增引物設計方式：
5’-上游載體末端同源序列+酶切位點（保留或刪除）+基因特異性正向擴增引物序列-3’
插入片段反向擴增引物設計方式：
3’-基因特異性反向擴增引物序列+酶切位點（保留或刪除）+下游載體末端同源序列-5’
3.線性化載體與插入片段濃度測定
使用NanoDrop或Qubit檢測線性化載體和插入片段的濃度。
4.重組反應體系的配制
1）線性化載體和插入片段使用量計算
載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3；當插入片段長度大于克隆載體時，將插入片段當作克隆載體，克隆載體當作插入片段計算。
2）在冰上配制反應體系：
3） 使用移液器輕輕吸打混勻并瞬時離心。
4） 50℃反應20min， 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。
5） 重組反應轉(zhuǎn)化、涂板，具體方法參照感受態(tài)細胞的說明書。
產(chǎn)品簡介：
NobleRyder? One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù)，可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點?？梢愿咝Ъ嫒?-5個片段同源重組，50℃反應10 - 30 min即可進行連接，適用于快速克隆，DNA定點突變等。
| 組分 | CLO01-20 | CLO01-50 |
| 2×NobleRyder? One Step Cloning Mix | 100 μL | 250 μL |
| 700bp Control Insert (10ng/μL) pCold Control Vector,linearized(20ng/μL) |
5 μL 10 μL |
5 μL 10 μL |
1.制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。盡量選擇無重復序列且載體克隆位點上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。載體線性化方式有限制性內(nèi)切酶酶切消化和反向PCR擴增。1）酶切制備線性化載體時，推薦使用雙酶切線性化，線性化完全5.1 制備線性化載體
選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化。選擇載體克隆位點附近無重復序列且上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點進行克隆。
1）酶切制備線性化載體，推薦使用雙酶切方案；單酶切線性化并不影響無縫鏈接，但可能會有更多的環(huán)狀質(zhì)粒殘留，增加后期克隆的篩選難度。
2）反向PCR擴增制備線性化載體，必須使用高保真DNA聚合酶進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR產(chǎn)物需要進行膠回收，減少環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀DNA模板的殘留。
2.制備插入片段
通過在插入片段正、反向引物5，端引入15-25bp線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5，端和3，端的末端分別帶有與線性化載體的兩個末端對應的完全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴增，獲得PCR產(chǎn)物后進行瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收正確的產(chǎn)物片段。
插入片段正向擴增引物設計方式：
5’-上游載體末端同源序列+酶切位點（保留或刪除）+基因特異性正向擴增引物序列-3’
插入片段反向擴增引物設計方式：
3’-基因特異性反向擴增引物序列+酶切位點（保留或刪除）+下游載體末端同源序列-5’
3.線性化載體與插入片段濃度測定
使用NanoDrop或Qubit檢測線性化載體和插入片段的濃度。
4.重組反應體系的配制
1）線性化載體和插入片段使用量計算
載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3；當插入片段長度大于克隆載體時，將插入片段當作克隆載體，克隆載體當作插入片段計算。
2）在冰上配制反應體系：
| 組分 | 實驗組 | 陰性對照 | 陽性對照 |
| 線性化載體 | X | X | pCold Control Vector,linearized 1 μL |
| 插入片段 | Y | 0 | 700bp Control Insert 1 μL |
| 2×NobleRyder? One Step Cloning Mix | 5 | 0 | 5 μL |
| DNase-Free Water | to 10μL | to 10μL | to 10μL |
4） 50℃反應20min， 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。
5） 重組反應轉(zhuǎn)化、涂板，具體方法參照感受態(tài)細胞的說明書。