產(chǎn)品說(shuō)明：
Cell Counting Kit-8 簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒?？捎糜谒幬锖Y選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏等試驗(yàn)
使用說(shuō)明：
一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）
1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
2、按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。
3、接種后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X 軸），OD 值為縱坐標(biāo)（Y 軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。）
二、細(xì)胞活性檢測(cè)
1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃,5% CO2的條件下）。
2、向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
5、如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，打算以后測(cè)定的話(huà)，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
三、細(xì)胞增值-毒性檢測(cè)
1、在96孔板中配置100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（在37 ℃，5% CO2的條件下）。
2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。
3、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。
4、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
5、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
6、如果暫時(shí)不測(cè)定OD 值，打算以后測(cè)定的話(huà)，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
活力計(jì)算：.
細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0加藥)－A(空白)]×100
A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度
A（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度
細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
注意事項(xiàng)：
①建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
②白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。
③當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1 ,000個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 ( 100 μL培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10% 加入CCK-8溶液。
④如果沒(méi)有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm檢測(cè)靈敏度最高。
⑤培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
CCK-8法與其它檢測(cè)方法之間的比較：
細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 MTT法 XTT 法 WST-1 法 CCK-8法
形成的formazan 的水溶性 差 好 好 好
產(chǎn)品性狀 粉末 2 瓶溶液 溶液 1瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用 現(xiàn)配現(xiàn)用 無(wú)需預(yù)制 無(wú)需預(yù)制
檢測(cè)靈敏度 高 很高 很高 高
檢測(cè)時(shí)間 較長(zhǎng) 較短 較短 最短
檢測(cè)波長(zhǎng) 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
細(xì)胞毒性 高，細(xì)胞形態(tài)完全消失 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變
試劑穩(wěn)定性 一般 較差 一般 很好
大批量樣品檢測(cè) 可以 非常適合 非常適合 非常適合
便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷
Cell Counting Kit-8 簡(jiǎn)稱(chēng)CCK-8試劑盒，為MTT法的替代方法，是一種基于WST（水溶性四唑鹽，化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒?？捎糜谒幬锖Y選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性測(cè)定、腫瘤藥敏等試驗(yàn)
使用說(shuō)明：
一、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（測(cè)定細(xì)胞具體數(shù)量時(shí)）
1、先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。
2、按比例依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。
3、接種后培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定OD 值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)（X 軸），OD 值為縱坐標(biāo)（Y 軸）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量（試用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。）
二、細(xì)胞活性檢測(cè)
1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（在37℃,5% CO2的條件下）。
2、向每孔加入10μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。
3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。
5、如果暫時(shí)不測(cè)定OD值，打算以后測(cè)定的話(huà)，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
三、細(xì)胞增值-毒性檢測(cè)
1、在96孔板中配置100 μL 的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)（在37 ℃，5% CO2的條件下）。
2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間（例如：6、12、24或48小時(shí)）。
3、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話(huà)，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。
4、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。
5、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度。
6、如果暫時(shí)不測(cè)定OD 值，打算以后測(cè)定的話(huà)，可以向每孔中加入10μL 0.1M的HCl或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。
活力計(jì)算：.
細(xì)胞活力（％）=[A(加藥)－A(空白)]／[ A(0加藥)－A(空白)]×100
A（加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒(méi)有細(xì)胞的孔的吸光度
A（0 加藥）：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒(méi)有藥物溶液的孔的吸光度
細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力
注意事項(xiàng)：
①建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。
②白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間。
③當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96 孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1 ,000個(gè)/孔 (100 μL培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500 個(gè)/孔 ( 100 μL培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10% 加入CCK-8溶液。
④如果沒(méi)有450nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之間的濾光片，但是450nm檢測(cè)靈敏度最高。
⑤培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)，通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會(huì)對(duì)檢測(cè)造成影響。
CCK-8法與其它檢測(cè)方法之間的比較：
細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 MTT法 XTT 法 WST-1 法 CCK-8法
形成的formazan 的水溶性 差 好 好 好
產(chǎn)品性狀 粉末 2 瓶溶液 溶液 1瓶溶液
使用方法 配成溶液后使用 現(xiàn)配現(xiàn)用 無(wú)需預(yù)制 無(wú)需預(yù)制
檢測(cè)靈敏度 高 很高 很高 高
檢測(cè)時(shí)間 較長(zhǎng) 較短 較短 最短
檢測(cè)波長(zhǎng) 560-600nm 420-480nm 420-480nm 430-490nm
細(xì)胞毒性 高，細(xì)胞形態(tài)完全消失 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變 很低，細(xì)胞形態(tài)不變
試劑穩(wěn)定性 一般 較差 一般 很好
大批量樣品檢測(cè) 可以 非常適合 非常適合 非常適合
便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷
