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產(chǎn)品說明：
線粒體是細(xì)胞超氧化物的主要生產(chǎn)者。產(chǎn)生低至中等水平的超氧化物對于正確調(diào)節(jié)許多基本細(xì)胞過程至關(guān)重要，包括基因表達(dá)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和肌肉對耐力運(yùn)動訓(xùn)練的適應(yīng)。不受控制的線粒體超氧化物產(chǎn)生會引發(fā)細(xì)胞氧化損傷，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和衰老。因此，細(xì)胞內(nèi)線粒體超氧化物的檢測對于了解適當(dāng)?shù)募?xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)及其失調(diào)對各種病理的影響至關(guān)重要。細(xì)胞計?熒光線粒體超氧化物活性測定試劑盒使用我們獨(dú)特的超氧化物指示劑來量化活細(xì)胞中的超氧化物水平。MitoROS? 580是活細(xì)胞通透性的，可以快速，選擇性地靶向線粒體中的超氧化物。當(dāng)它與超氧化物反應(yīng)時會產(chǎn)生紅色熒光。細(xì)胞計?熒光法細(xì)胞內(nèi)超氧化物檢測試劑盒提供靈敏的一步熒光測定，可在孵育一小時后檢測活細(xì)胞中的線粒體超氧化物。該試劑盒針對流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用進(jìn)行了優(yōu)化。
組件
組件 A：MitoROS? 580—1瓶
組分B：檢測緩沖液—1 瓶 （10 mL）
組件C：DMSO—1 瓶 （100 μL）

1. 制備密度為 0.5 - 1 × 10 的細(xì)胞6細(xì)胞/毫升
2. 用測試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物
3. 將 1 μL 500X MitoROS? 580 加入 0.5 mL 細(xì)胞懸液中
4. 將細(xì)胞在 37°C 下染色 1 小時
5. 使用帶FL2通道的流式細(xì)胞儀監(jiān)測熒光強(qiáng)度

重要說明：在開始實(shí)驗(yàn)之前，請在室溫下解凍所有組分。
儲備液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C。避免反復(fù)凍融循環(huán)。
1. MitoROS 580儲備溶液（500X）：
將100μLDMSO（組分C）加入MitoROS 580（組分A）的小瓶中，混合均勻，制成500X MitoROS??? 580儲備溶液。避光。注意：儲存時，請密封管子。
實(shí)驗(yàn)方案樣本

1. 對于每個樣品，在您選擇的 0.5 mL 生長培養(yǎng)基或緩沖液中制備細(xì)胞，密度為 5×10⁵至 1×10⁶細(xì)胞/毫升。注意：應(yīng)單獨(dú)評估每個細(xì)胞系，以確定超氧化物誘導(dǎo)的最佳細(xì)胞密度。
2. 在檢測緩沖液（組分 B）或所需緩沖液（如 PBS）中用 25 μL 20X 測試化合物處理細(xì)胞以誘導(dǎo)超氧化物。對于對照細(xì)胞（未處理的細(xì)胞），加入相應(yīng)量的復(fù)合緩沖液。
3. 將細(xì)胞在37°C下孵育至少30分鐘或所需的時間，避光。注意：用50μM抗霉素A（AMA）在37°C下處理Jurkat細(xì)胞30分鐘以誘導(dǎo)超氧化物?；摶ㄇ嗨兀?0μM）或H₂O₂（1 mM） 也可用于誘導(dǎo)超氧化物。
4. 將 1 μL 500X MitoROS? 580 儲備溶液加入 0.5 mL 細(xì)胞懸液中。
5. 在 37°C 下孵育 1 小時。注意：對于貼壁細(xì)胞，用0.5 mM EDTA輕輕提起細(xì)胞以保持細(xì)胞完整，并在用MitoROS? 580孵育之前用含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。適當(dāng)?shù)姆跤龝r間取決于所使用的單個細(xì)胞類型和測試化合物。優(yōu)化每個實(shí)驗(yàn)的孵育時間。
6. 使用具有FL2通道的流式細(xì)胞儀（Ex / Em = 488 / 590 nm）監(jiān)測熒光強(qiáng)度。對感興趣的細(xì)胞進(jìn)行門控，不包括碎片。